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As técnicas de estria de esgotamento e coloração de gram são práticas essenciais na microbiologia, utilizadas para identificar e isolar microrganismos com precisão. Amplamente empregadas em laboratórios para diagnóstico, pesquisa e controle de qualidade em diversas áreas. O presente estudo teve como finalidade geral identificar morfologicamente e fenotipicamente linhagens presuntivas de Escherichia coli isoladas de amostras da água utilizada nas queijarias produtoras do Queijo Minas Artesanal Canastra. A finalidade deste trabalho foi a de caracterizar e garantir a identificação precisa de cepas dessa bactéria isoladas originalmente por meio de plaqueamento em ágar Chromocult®. Foram reativados 318 isolados presuntivos de Escherichia coli mantidos na coleção taxonômica do Laboratório de Biologia Molecular do IFMGcampus Bambuí, isolados a partir de amostras de água coletadas na estação seca entre julho e agosto de 2022. Os isolados presuntivos sofreram reativação a partir de amostras criopreservadas, que foram cultivados em Ágar MacConkey. No crescimento neste meio foi evidenciado crescimento bacteriano de coloração rosa em 177 isolados confirmados como E. coli, crescimento de 48 isolados de coloração branca considerados como isolados que não são E. coli e os 93 isolados restantes não apresentaram capacidade de crescimento no Ágar MacConkey, provavelmente por se tratarem de bactérias gram-positivas. Para aquelas isolados com crescimento de colônias de coloração branca foi realizada uma etapa adicional através de coloração de gram garantindo ainda mais a exclusão destes isolados como E. coli, uma vez que sua morfologia foi de cocos gram positivos. Os resultados obtidos neste estudo contribuem para melhor compreensão acerca da identificação da espécie estudada, sobretudo, no que tange dados fornecidos a partir de testes morfológicos e fenotípicos cruciais em etapas posteriores ao plaqueamento utilizando ágar Chromocult®.