A região da Serra da Canastra é conhecida por sua tradicional produção de Queijo Minas Artesanal, a linha de produção desse alimento é caracterizada por várias propriedades rurais que utilizam das nascentes do rio São Francisco como fonte de abastecimento para todo empreendimento. A utilização desses mananciais sem tratamento se evidencia como um grande potencial de contaminação fecal oriunda de animais domésticos e silvestres tornando esses cursos de águas grandes reservatórios de enterobactérias, incluindo Escherichia coli responsável por uma variedade de doenças, principalmente infecções intestinais. A identificação molecular é um relevante instrumento para analisar a carga microbiana desse alimento, bem como, das medidas necessárias de controle da sua produção. O presente estudo teve como objetivo geral caracterizar molecularmente a diversidade genética de isolados de Escherichia coli obtidos a partir de amostras de água de 12 mananciais que abastecem propriedades rurais que produzem o Queijo Canastra. Foram obtidos 318 isolados de E. coli e utilizando a técnica molecular de DNA fingerprinting rep-PCR (GTG)5 foram identificados 141 perfis genéticos de E. coli. O local de amostragem com o maior número de diferentes perfis genéticos foi o rio 08, enquanto que o rio 06 representou o ponto de amostragem com a menor riqueza de perfis genéticos. Os resultados encontrados evidenciaram que os diferentes pontos amostrais possuem diferentes isolados de E. coli e que dependendo do Rio amostrado a diversidade genética presente pode variar. Considerando que, há diversidade genética nas populações de E. coli, é possível que exista também diferenças na capacidade destes isolados em apresentar genes de virulência e de resistência a antimicrobianos, parâmetros importantes para o monitoramento da qualidade da água para o abastecimento de propriedades envolvidas na produção do Queijo Canastra.